La microscopie confocale

Auteurs : Maura Francis, Cory Boone, Jaclyn Wycoff

La microscopie confocale est un type de microscopie à fluorescence qui utilise un laser pour exciter la fluorescence des fluorophores utilisés pour marquer différents sous-ensembles d'un spécimen. Les microscopes à fluorescence sont utilisés pour l'imagerie des cellules et des tissus qui ont été marqués par fluorescence.¹ La microscopie confocale se distingue de la microscopie à épifluorescence conventionnelle par sa résolution accrue lors de l'imagerie de spécimens épais, l'élimination de l'éblouissement hors foyer dû au filtrage spatial et la réduction des dommages causés à l'échantillon par la lumière, connus sous le nom de phototoxicité.

Au lieu d'utiliser une source incohérente de lampe au tungstène ou au mercure comme les microscopes classiques, les microscopes confocaux utilisent un laser pour éclairer l'échantillon.¹ Le système recueille ensuite des images sur des plans situés à différentes profondeurs dans l'échantillon, appelés sections optiques, en balayant le laser à différentes positions de mise au point.¹ Les sections optiques permettent d'imager des spécimens vivants car il n'est pas nécessaire de sectionner physiquement l'échantillon. L'éclairage de sections plus petites permet également aux spécimens de rester viables plus longtemps en réduisant considérablement les effets de la phototoxicité. La quantité de lumière que les techniques conventionnelles utilisent pour l'éclairage ne permet pas de garantir la vitalité du spécimen imagé, ce qui est indispensable lors de la capture d'événements biologiques.¹

Apparence de l'image

Comparées aux images capturées par un microscope à fluorescence classique, les images provenant d'un système de microscope confocal présentent une augmentation marginale de la résolution axiale et latérale, mais le filtrage spatial par le sténopé du système bloque la fluorescence hors foyer pour une image beaucoup plus détaillée (Figure 1).² Le contraste de l'image est amélioré par rapport aux méthodes traditionnelles en raison d'une réduction du bruit de fond et d'un meilleur rapport signal/bruit. Lors de l'utilisation des techniques conventionnelles, la fluorescence émise par les parties adjacentes de l'échantillon interfère avec le plan d'image et obscurcit le foyer.¹ Ceci est problématique car il n'y a aucun moyen de différencier la fluorescence qui ne contribue pas au plan focal imagé, ce qui est particulièrement évident dans les échantillons dont l'épaisseur est supérieure à deux micromètres.¹ En utilisant des techniques de filtrage spatial, les microscopes confocaux sont capables d'éliminer ce problème en bloquant toute lumière hors foyer qui obscurcirait l'image.² La microscopie confocale et la microscopie multiphotonique ont une résolution similaire dans les axes x et y, mais la microscopie multiphotonique a une résolution supérieure dans l'axe z, ou profondeur. Par rapport à la microscopie multiphotonique, la microscopie confocale n'utilise qu'un seul photon pour exciter les colorants fluorescents, ce qui peut entraîner une plus grande dispersion de la lumière dans l'image et l'impossibilité d'obtenir une image aussi profonde dans un échantillon. Les techniques confocales utilisent généralement la lumière du spectre visible, qui a également tendance à se diffuser et à s'absorber davantage dans les tissus biologiques que les longueurs d'onde plus importantes, ce qui peut limiter la profondeur de pénétration possible dans un échantillon. Cependant, la technique confocale s'est toujours avérée avoir une meilleure résolution que les techniques traditionnelles à champ large, ce qui permet de la considérer comme un pont entre les méthodes classiques à champ large et les techniques plus avancées de super-résolution. La microscopie confocale est très bien adaptée à l'imagerie des cultures cellulaires en 2D, tandis que la microscopie multiphotonique et la microscopie à nappe de lumière offrent des avantages pour l'imagerie des échantillons en 3D.

Figure 1 : Une image de protoplastes capturée à l'aide de la microscopie confocale (à gauche) qui est plus finement focalisée qu'une image de microsphères de taille similaire capturée à l'aide de la microscopie conventionnelle à épifluorescence.

Détails techniques

La figure 2 illustre la disposition typique d'un microscope confocal dans lequel on trouve quatre composants clés :

Source d'excitation laser : émet un faisceau laser dans le système pour se concentrer sur l'échantillon.
Filtres dichroïques à fluorescence : ils réfléchissent la lumière d'excitation sur l'échantillon et transmettent la fluorescence secondaire, émise par l'échantillon, au système de détection.
Sténopé : composant essentiel des assemblages confocaux, il agit comme un filtre spatial. Il empêche toute lumière qui n'est pas confocale au plan focal de l'objectif d'interférer avec l'image.²
Moteurs pas à pas : permet au faisceau laser de se déplacer de manière incrémentielle sur l'échantillon, en obtenant des balayages x et y collectés le long de l'axe z. La collecte des données tridimensionnelles est ainsi automatisée, ce qui permet de créer facilement une image 3D.²
Objectif : un objectif à haute ouverture numérique (NA) est généralement utilisé pour obtenir de hautes résolutions. Les modèles à immersion dans l'eau ou dans l'huile sont souvent utilisés pour ajuster le décalage de l'indice de réfraction entre le milieu aqueux dans lequel sont conservés de nombreux échantillons vivants. De longues distances de travail sont nécessaires pour les échantillons épais et l'imagerie 3D/sectionnement optique.

Figure 2 : Schéma d'un système de microscopie confocale typique

Comparaison avec d'autres techniques de microscopie³

Technique	Résolution	Taille de l'échantillon	Coût relatif	Photoblanchiment
Microscopie confocale	<µm	µm	$$	Oui
Microscopie multiphotonique	<µm	mm	$$$	Moins
Microscopie en fluorescence à nappe de lumière	µm	>cm	$	Le moins

La microscopie confocale chez Edmund Optics®

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Références

Paddock, Stephen W., et al. "Introductory Confocal Concepts" Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/confocal/introductory-confocal-concepts.
Fellers, Thomas J., and Michael W. Davidson. “Introduction to Confocal Microscopy.” Olympus Scientific Solutions Americas Corp., https://www.olympus-lifescience.com/ru/microscope-resource/primer/techniques/confocal/confocalintro/.
Santi, P. A. (2011). Light Sheet Fluorescence Microscopy. J Histochem Cytochem, 59(2), 129-138. doi: 10,1369/0,022,155,410,394,857.