La microscopie multiphotonique

Auteurs : Maura Francis, Cory Boone, Jaclyn Wycoff

La microscopie multiphotonique – également appelée microscopie linéaire – est idéale pour capturer des images tridimensionnelle (3D) à haute résolution – avec une réduction du photoblanchiment et de la phototoxicité par rapport aux techniques traditionnelles de microscopie confocale. Il s'agit de la méthode privilégiée pour l'analyse d'échantillons épais de tissus vivants en raison du sectionnement optique avancé de la méthode sans absorption hors foyer.

La microscopie multiphotonique est un sous-ensemble de la microscopie à fluorescence qui utilise des techniques d'imagerie similaires à celles de la microscopie à fluorescence conventionnelle pour différencier les structures des cellules ou des tissus vivants à l'aide de divers marqueurs fluorescents appelés fluorophores. Les longueurs d'onde laser d'une énergie suffisante excitent les fluorophores pour qu'ils émettent une lumière qui génère une image. Un seul photon est nécessaire pour exciter un fluorophore dans les techniques conventionnelles. La fluorescence hors foyer est souvent un problème dans la microscopie à fluorescence standard en raison de la fluorescence provenant d'autres plans qui interfère avec le plan focal. La microscopie confocale traditionnelle combat ce problème en bloquant toute lumière hors foyer à l'aide d'un sténopé placé devant le détecteur. Cependant, cette technique n'est pas idéale pour l'imagerie de spécimens épais en raison de la diffusion et de l'absorption. La qualité de l'image commence à se détériorer à des épaisseurs d'environ 100 µm, mais dans certains échantillons la qualité de l'image peut être maintenue jusqu'à 700 µm.¹

Comme son nom l'indique, plusieurs photons sont absorbés simultanément pour exciter les fluorophores dans la microscopie multiphotonique. La lumière d'excitation est confinée à un très petit volume tridimensionnel (Figure 1), de sorte que cette technique présente des niveaux de diffusion plus faibles que la microscopie confocale traditionnelle. La quantité de lumière diffusée est également inversement proportionnelle à la puissance quatre de la longueur d'onde de la lumière. Les techniques traditionnelles utilisent des lumières ultraviolettes (UV) ou visibles, qui se diffusent beaucoup plus que la lumière infrarouge. La réduction de la diffusion et de l'absorption des longueurs d'onde infrarouges généralement utilisées en microscopie multiphotonique permet une pénétration plus profonde dans un échantillon.²

Figure 1 : La lumière d'excitation résultant de la microscopie multiphotonique est confinée à une région beaucoup plus petite de l'échantillon que celle résultant des techniques à photon unique.

La microscopie multiphotonique et la microscopie confocale sont presque identiques en termes d'instrumentation, mais la microscopie multiphotonique utilise des lasers à impulsions ultracourtes, comme les lasers femtosecondes. Les lasers à impulsions ultracourtes ont une puissance de crête élevée et une courte durée d'impulsion, deux caractéristiques nécessaires pour exciter les fluorophores. Beaucoup de ces lasers émettent dans les régions du proche infrarouge et de l'infrarouge et ont des taux de répétition élevés, ce qui s'est avéré bénéfique pour les échantillons biologiques vivants.³ Les pics de puissance élevés permettent une meilleure résolution de l'imagerie et contribuent à la réduction de la diffusion. Contrairement à la microscopie confocale, la microscopie multiphotonique ne nécessite pas de sténopé car la fluorescence hors foyer est considérablement réduite en raison du volume d'excitation confiné en trois dimensions.

Comment cela fonctionne

Une fenêtre est parfois introduite dans l’objet examiné pour une pénétration maximale dans les tissus. La pénétration de la lumière est généralement limitée à 1-2 mm à travers le tissu lui-même. En utilisant un laser infrarouge (IR) tel qu'un laser Ti:saphir, moins de lumière est diffusée et la profondeur de pénétration augmente.⁴ Les photons de longue longueur d'onde ont moins d'énergie que les photons de courte longueur d'onde et, par conséquent, plusieurs photons IR sont nécessaires pour exciter un fluorophore à un état d'énergie plus élevé (Figure 2). Si un fluorophore est généralement excité par un photon d'une longueur d'onde de 350 nm, dans la microscopie à deux photons, ce même fluorophore peut être excité par deux photons d'une longueur d'onde de 700 nm chacun. Le même concept s'applique à la microscopie à trois photons, sauf que trois photons ayant une longueur d'onde triple de celle requise pour l'absorption à photon unique sont nécessaires pour exciter le fluorophore. Pour que plusieurs photons contribuent à une excitation unique, le laps de temps qui les sépare doit être extrêmement court. C'est pourquoi il faut recourir à des lasers à impulsions ultracourtes avec des taux de répétition élevés.

L'utilisation des longueurs d'onde du proche infrarouge présente l'avantage supplémentaire de permettre une imagerie répétitive et une diffusion moindre que celle des longueurs d'onde UV, qui peuvent également provoquer un photoblanchiment important. La microscopie multiphotonique contourne plusieurs des inconvénients des techniques basées sur l'excitation UV et permet aux utilisateurs d'obtenir des images plus profondes dans un spécimen.⁴ Les longueurs d'onde UV provoquent également davantage de photodommages dans les échantillons biologiques.

Figure 2 : Dans l'absorption monophotonique (A), un seul photon ultraviolet (UV) est absorbé pour produire une fluorescence. La microscopie multiphotonique utilise l'absorption à deux photons (B) ou à trois photons (C), dans laquelle plusieurs photons sont absorbés pour produire une fluorescence.

L'excitation multiphotonique se produit lorsque les énergies de plusieurs photons incidents sur le fluorophore correspondent simultanément à l'énergie de transition nécessaire pour l'exciter à partir de son état fondamental. Le fluorophore absorbe deux ou trois photons à la fois, selon la technique utilisée (microscopie à deux ou trois photons). L'absorption dépend du carré de l'intensité de l'excitation, de sorte que l'absorption à deux ou trois photons ne se produit qu'au point focal du système, où la densité de photons est la plus élevée. Cela empêche toute fluorescence hors foyer d'obscurcir l'image et élimine la nécessité d'un sténopé, ce qui différencie la microscopie multiphotonique de la microscopie confocale traditionnelle. Des impulsions rapides et continues sont envoyées dans le système pour augmenter la probabilité d'absorption simultanée.² Lorsqu'un tel laser est focalisé, les photons sont plus nombreux et la densité spatiale augmente.⁴ Cela augmente également la probabilité globale d'interaction des fluorophores au même instant. L'excitation multiphotonique nécessite des impulsions laser avec des puissances de crête élevées et des durées d'impulsion de l'ordre de la femtoseconde.

Apparence de l'image

Comme toute la fluorescence provient d'un petit volume au point de focalisation, la microscopie multiphotonique recueille l'intensité de toute la lumière émise par l'échantillon.⁵ Le laser d'excitation est balayé sur l'échantillon pour déclencher la fluorescence et générer le champ de vision complet de l'image. Comme l'absorption multiphotonique ne se produit pas en dehors du volume focal, il est possible d'obtenir des images à haute résolution à différentes profondeurs dans l'échantillon. En raison de l'excitation localisée qui empêche la lumière hors foyer d'obscurcir l'image, la microscopie à deux photons a la même résolution dans les axes x et y que la microscopie confocale traditionnelle.⁵ Les techniques de microscopie à deux et trois photons ont une meilleure résolution sur l'axe des z, car la fluorescence hors foyer est réduite au minimum en trois dimensions⁵. Ainsi, de plus petites sections transversales sont collectées, ce qui permet de distinguer des détails plus fins, comme le montre la Figure 3.

Dans la plupart des configurations des systèmes de microscopie multiphotonique, des tubes photomultiplicateurs sont utilisés pour détecter les signaux avec une grande sensibilité. Cette configuration permet une acquisition rapide des données, ce qui serait bénéfique dans les applications qui nécessitent un retour d'information quasi instantané. Des caméras de vision industrielle dotées de détecteurs CCD (charged couple device) ou CMOS (complementary metal-oxide semiconductor) peuvent également être utilisées dans des voies supplémentaires pour acquérir une image à champ large de l'échantillon.²

Figure 3 : Image d'une tumeur de souris capturée à l'aide de la microscopie multiphotonique, avec l'aimable autorisation du Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI) de l'université du Wisconsin à Madison.⁶

Détails techniques

La Figure 4 illustre la disposition typique d'un microscope multiphotonique. Une multitude de composants optiques sont présents dans un système multiphotonique. Les composants typiques d'un système multiphotonique sont les suivants :

Source d'excitation laser IR : La source IR, telle qu'un laser Ti:saphir ou un laser à fibre ultrarapide, émet un faisceau laser avec des durées d'impulsion de l'ordre de la femtoseconde et une irradiance de pointe suffisamment élevée pour induire une absorption multiphotonique dans l'échantillon. Le coût élevé des lasers Ti:saphir rendait auparavant cette technique prohibitive dans certaines situations, mais des sources laser à fibre plus récentes et moins coûteuses facilitent désormais la microscopie multiphotonique.
Miroirs à faible dispersion de retard de groupe (GDD) : leur faible GDD permet de minimiser la dispersion chromatique et l'étalement des impulsions. Ces miroirs sont dotés de traitements diélectriques optimisés pour offrir une réflectance élevée pour la longueur d'onde laser pour laquelle ils sont conçus et pour minimiser la GDD. Les miroirs dichroïques à faible GDD sont utilisés pour séparer les signaux d'émission à différentes longueurs d'onde de fluorescence, tandis que les miroirs de balayage à faible GDD sont utilisés pour transmettre la fluorescence émise à un détecteur.
Filtres passe-bande, passe-bas, passe-haut et dichroïques : différents types de filtres, généralement passe-bande ou passe-bas, sont utilisés pour nettoyer les longueurs d'onde laser d'excitation, puis pour sélectionner des longueurs d'onde particulières pour la détection.⁷ Les filtres permettent de laisser passer les signaux non linéaires. Les filtres dichroïques sont souvent utilisés pour séparer les longueurs d'onde d'excitation et d'émission.
Objectif : souvent un objectif corrigé à l'infini à immersion dans l'eau ou l'huile, ce composant focalise la source d'excitation sur l'échantillon, induisant une absorption multiphotonique au point focal. La fluorescence est ensuite recollimatée à travers l'objectif et transmise au détecteur. Les objectifs pour la microscopie multiphotonique ont généralement une ouverture numérique (NA) élevée, un fort grossissement, une correction chromatique sur une large bande d'ondes et une longue distance de travail.
Lentille tube : placée derrière l'objectif pour focaliser la fluorescence collimatée afin d'obtenir une image primaire.
Détecteur : un tube photomultiplicateur (PMT), un objectif d'imagerie et une caméra, ou toute autre configuration de détecteur, collecte la fluorescence émise par le plan focal, ce qui permet d'obtenir des images à haute résolution. Des images 3D peuvent être générées en balayant à travers différents plans de focalisation et en assemblant les images entre elles.

Figure 4 : Schéma typique d'un système de microscopie multiphotonique.

Applications de la microscopie multiphotonique

Application 1 : L’imagerie cérébrale

La microscopie multiphotonique a permis aux chercheurs d'obtenir des images en profondeur du tissu cérébral d'une manière qu'ils n'avaient pas pu faire auparavant. En utilisant une technique à trois photons, les chercheurs peuvent obtenir des images de l'hippocampe, ce qui permet de comprendre comment les neurones sont générés dans le cerveau.⁸ Les scientifiques sont en mesure d'obtenir des images in vivo, ce qui peut être extrêmement utile pour diagnostiquer différentes pathologies. Une étude réalisée sur des souris a utilisé l'imagerie multiphotonique pour explorer les effets fonctionnels des neurones et des astrocytes dans la progression de la maladie d'Alzheimer. L'utilisation de l'imagerie in vivo pour voir ces structures peut permettre aux scientifiques de mieux comprendre la pathogenèse de la maladie. En étant capables de voir le cerveau par microscopie multiphotonique, les scientifiques et les chercheurs peuvent approfondir la façon dont la maladie progresse et développer de meilleures méthodes de traitement et de diagnostic.⁹

Application 2 : L’imagerie de la rétine

La microscopie multiphotonique a également permis d'obtenir des images de la rétine de l'œil. Les méthodes traditionnelles d'imagerie de la rétine empêchent l'observation des structures subcellulaires en raison des aberrations optiques que présente l'œil.⁷ L'imagerie de la rétine permet de diagnostiquer certaines maladies oculaires et d'identifier les maladies dégénératives du cerveau en raison du rôle de la rétine dans le système nerveux central. Cela peut fournir des indicateurs sur l'apparition de maladies comme la maladie d'Alzheimer ou la sclérose en plaques. L'utilisation de la microscopie multiphotonique est particulièrement avantageuse pour l'imagerie de l'œil car les lasers NIR n'interfèrent pas avec la stimulation du visible et l'œil est optiquement transparent aux grandes longueurs d'onde.⁷ La haute densité spatiale de la microscopie multiphotonique offre d'excellentes possibilités d'évaluer les structures de l'œil et de mieux comprendre les mécanismes des maladies.

Comparaison avec d'autres techniques de microscopie⁶

Technique	Résolution	Taille de l'échantillon	Coût relatif	Photoblanchiment
Microscopie confocale	<µm	µm	$$	Oui
Microscopie multiphotonique	<µm	mm	$$$	Moins
Microscopie en fluorescence à nappe de lumière	µm	>cm	$	Le moins

La microscopie multiphotonique chez Edmund Optics®

Edmund Optics® fournit une large gamme de composants optiques pour les applications de microscopie multiphotonique, notamment des miroirs à faible dispersion de retard de groupe (GDD), des filtres, des objectifs, des polariseurs et des réseaux. D'autres composants idéaux pour ces systèmes sont ajoutés en permanence, car l'espace d'application de la microscopie multiphotonique ne cesse de croître.

Miroirs à Faible GDD

Conçus avec une haute réflectivité pour modifier la trajectoire d'un faisceau laser ultrarapide
Options de traitement appliqué par pulvérisation ionique pour une faible dispersion et une faible absorption
Options de seuil de dommage laser élevé
GDD aussi basse que 0 ± 20 fs² à la gamme de longueurs d'onde de conception

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Miroirs Laser Ultrarapides Traités Argent Amélioré

Réflexion >99% (polarisation p) entre 600 et 1000 nm ou 800 et 1150 nm
Faible dispersion de retard de groupe 0 ± 20 fs²
Idéaux pour les lasers Ti:saphir et dopés Yb
Tailles standard impériales disponibles

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Miroirs Ultrarapides de Compression d’Impulsions d’UltraFast Innovations

Dispersion de retard de groupe hautement négatifs
Idéaux pour la compression d'impulsions ultracourtes
Une variété de traitements pour les longueurs d'onde courantes
Les composants optiques laser de pointe de UltraFast Innovations

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Filtres Passe-Bas Dichroïques Ultrarapides à Faible GDD

Épaisseur réduite pour une GDD limitée
Larges gammes de transmission et de réflexion
Idéaux pour les applications laser à impulsions ultracourtes
Spécification GDD contrôlée en utilisant la métrologie propre à l’entreprise

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Polariseurs Ultrarapides à Couche Mince

Idéaux pour les lasers ultrarapides Ti:saphir et dopés Yb
Optimisés pour la séparation des polarisations s et p à un AOI de 45°
Rapport d'extinction élevé de 1000:1 à la longueur d’onde de conception

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Objectifs Olympus à Immersion dans l'Eau

Objectifs à immersion dans l'eau avec des plages de grossissement de 10 à 40X
Affiche des images plates à partir de facteurs de transmission élevés jusqu'à la région du spectre de l’infrarouge proche
Idéaux pour l'imagerie par fluorescence des tissus et des échantillons, tels que les tissus cérébraux

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Objectifs Apochromatiques Étendus Olympus X-Line

Grandes ouvertures numériques (NA) jusqu’à 1,45
Correction d'aberration chromatique de 400 à 1000 nm
Planéité d'image uniforme sur de grands champs de vision

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Objectifs Mitutoyo Corrigés à l’Infini - Longue Distance de Travail

Longues distances de travail
Inspection à fond clair
Design plan-apochromatique de haute qualité
Image plane le long du champ de vision

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Objectifs Réfléchissants

Longue distance de travail pour une intégration simple dans les systèmes
Activement alignées pour une performance optimale
Bande spectrale ultra-large de 190 nm à 11 μm sans aberration chromatique
Options limitées par la diffraction avec un front d'onde transmis de λ/14 RMS

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$Réseaux de Diffraction$

Réseaux de Diffraction

Grande variété de modèles gravés et holographiques
Options de haute précision avec une tolérance d'espacement des rainures <0,05 %
De nombreux types de réseaux sont disponibles dans des tailles personnalisées

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Références

Allen, John R. “Light Sheet Fluorescence Microscopy.” Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/light-sheet/light-sheet-fluorescence-microscopy
Piston, David W., et al. “Multiphoton Microscopy.” Nikon, https://www.microscopyu.com/techniques/multi-photon/multiphoton-microscopy.
“Two-Photon Microscopy.” Laser Quantum, https://www.laserquantum.com/applications/detail.cfm?id=24#:~:text=The%20laser%20used%20for%20two,interested%20in%20imaging%20living%20cells.
Larson, Adam M. “Multiphoton Microscopy.” Nature, 22 Dec. 2010, https://www.nature.com/articles/nphoton.an.2010.2.
Davidson, Michael W., and David W. Piston. “Introduction to Multiphoton Fluorescence Microscopy.” Olympus Scientific Solutions Americas Corp., https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-resource/primer/techniques/fluorescence/multiphoton/multiphotonintro/
Wendt, Kristy. “Multiphoton Microscopy and Second Harmonic Generation.” Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin, Madison, https://loci.wisc.edu/research/two-photon.
Qin, Zhongya, et al. “Adaptive optics two-photon microscopy enables near-diffraction-limited and functional retinal imaging in vivo.” Light: Sciences Applications, https://www.nature.com/articles/s41377-020-0317-9
May, Mike. “Shedding light on deep tissue: Multiphoton microscopy.” Science Magazine, https://www.sciencemag.org/features/2019/03/shedding-light-deep-tissue-multiphoton-microscopy.
Kelly, Patricia et al. “In Vivo two photon imaging of astrocytic structures and function in Alzheimer’s disease.” Aging Neurosci, https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnagi.2018.00219/full
Santi, P. A. (2011). Light Sheet Fluorescence Microscopy. J Histochem Cytochem, 59(2), 129-138. doi: 10,1369/0,022,155,410,394,857.