Imagerie par Fluorescence Illuminée au Laser
Un système d’imagerie ou de microscopie par fluorescence est typiquement constitué de trois éléments majeurs : une source de lumière, un échantillon de fluorophore photo-activé et un détecteur. Toute lumière incidente sur l’échantillon dans sa bande d’excitation amènera le fluorophore à émettre de la lumière. L’échantillon absorbe en général les photons dans sa bande d’excitation et émet des photons d'énergie plus faible et de longueurs d’onde plus grandes dans sa bande d’émission. La fluorescence par excitation à deux photons est un autre mécanisme de fluorescence qui peut se produire lorsqu’un fluorophore est excité par un photon ayant une longueur d’onde deux fois plus grande qu’une longueur d’onde de sa bande d’excitation. La fluorescence qui se produit de cette manière requiert deux photos pour atteindre l’énergie minimale nécessaire à la fluorescence car les photons de cette région de longueur d’onde doublée ont deux fois moins d’énergie.
La performance du système peut être améliorée en utilisant deux filtres : un filtre entre la source de lumière et l’échantillon et un deuxième filtre entre l’échantillon et le détecteur. L’objectif du filtrage est de réduire le spectre de lumière aux bandes d’excitation ou d’émission. La performance du système peut être améliorée davantage en utilisant une source lumineuse d'une longueur d'onde unique qui soit entièrement contenue dans une bande d’excitation comme un laser ce qui élimine tout besoin de filtre d’excitation.
Les graphiques ci-dessous montrent des exemples de fluorophores courants, et leur apparient un éclairage laser et un filtre d’émission qui pourraient être utilisés dans un système d’imagerie ou de microscopie à fluorescence de haute performance. Les deux courbes bleues représentent les bandes d’excitation et d’émission du fluorophore, tandis que la courbe verte montre le profil de transmission d’un filtre qui isolerait convenablement le pic de transmission de la bande d’émission.
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