Fluorophores et filtres pour la microscopie à fluorescence

Cette note correspond à la Section 9.3 du Guide de Ressources en Imagerie.

La microscopie à fluorescence est une technique de microscopie qui utilise la fluorescence induite par des fluorophores, par opposition à l'absorption, la diffusion ou la réflexion. Un fluorophore (ou fluorochrome) est un colorant fluorescent utilisé pour marquer des protéines, des tissus et des cellules afin de les examiner par microscopie à fluorescence. Un fluorophore fonctionne en absorbant l'énergie de longueurs d'onde spécifiques, communément appelées la gamme d'excitation, et en réémettant cette énergie dans une autre région de longueur d'onde spécifique, appelée la gamme d'émission.

Les systèmes de microscopie à fluorescence comme le microscope épifluorescent peuvent être simples, alors que les systèmes confocaux ou multiphotons peuvent être très complexes. Cependant, tous les microscopes à fluorescence partagent le même concept de base
: l'énergie d'excitation illumine un échantillon qui libère une énergie d'émission faible mais quantifiable. Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission ne partagent pas la même longueur d'onde centrale. Des filtres spécialisés permettent ainsi d'augmenter le contraste et le signal global.

Figure 1 : Une configuration typique de microscope à fluorescence.

Le concept et le schéma les plus élémentaires sont présentés à la Figure 1. Un arrangement de filtres est constitué de trois types de filtres : un filtre d'excitation, un filtre dichroïque et un filtre d'émission.

Filtre n° 1 : Filtre d’excitation

Le filtre d'excitation est placé dans le rayon d'éclairement d'un microscope à fluorescence. Son but est de filtrer l'ensemble des longueurs d'onde de la source de lumière, à l'exception de la plage d'excitation du fluorophore sous inspection. Le pourcentage minimum de transmission du filtre déterminera la luminosité et la brillance des images. Edmund Optics recommande une transmission minimum de 40% pour tout filtre d'excitation, avec une transmission idéale supérieure à 85%. La largeur de bande du filtre d'excitation doit être entièrement comprise dans la plage d'excitation du fluorophore, de telle sorte que la longueur d'onde centrale (CWL) du filtre soit aussi proche que possible de la longueur d'onde d'excitation maximale du fluorophore. La densité optique (OD) du filtre d'excitation détermine l'obscurité du fond de l’image ; elle est une mesure de la capacité d'un filtre à bloquer les longueurs d'onde situées en dehors de la plage de transmission ou de la bande passante. Une OD minimum de 3,0 est recommandée, mais un diamètre extérieur de 6,0 ou plus est idéal.

Filtre n° 2 : Filtre dichroïque ou séparateur de faisceau

Le filtre dichroïque est placé entre le filtre d'excitation et le filtre d'émission à un angle de 45° et reflète le signal d'excitation vers le fluorophore tout en transmettant le signal d'émission vers le détecteur. Les filtres dichroïques et les séparateurs de faisceau idéaux présentent des transitions nettes entre la réflexion maximale et la transmission maximale, avec une réflexion >95% pour la largeur de bande du filtre d'excitation et une transmission >90% pour la largeur de bande du filtre d'émission. Sélectionnez le filtre en tenant compte de la longueur d'onde d'intersection (λ) du fluorophore, afin de minimiser la lumière parasite et de maximiser le rapport signal/bruit de l'image fluorescente.

Filtre n° 3 : Filtre d’émission

Le filtre d'émission est placé dans le trajet d'imagerie du microscope à fluorescence et filtre la gamme d'excitation du fluorophore tout en transmettant la gamme d'émission. Les mêmes recommandations pour les filtres d'excitation valent pour les filtres d'émission : transmission minimale, largeur de bande, OD et CWL. Un filtre d'émission présentant une combinaison idéale de CWL, de transmission minimale et d’OD fournit les images les plus lumineuses possibles, avec le blocage le plus profond possible, et assure la détection des signaux d'émission les plus faibles.

Figure 2 : Une courbe spectrale de fluorophore généralisée.

La Figure 2 montre un profil typique d'excitation et d'émission. Les profils d'absorption et d'émission partagent des longueurs d'onde communes, ce qui est l'une des raisons pour lesquelles des filtres de haute qualité avec une transmission élevée, des largeurs de bande étroites, des OD élevées et des bandes de coupure cut-on et cut-off sont nécessaires. L'utilisation de filtres de mauvaise qualité peut finalement endommager l'échantillon, la préparation ou les capteurs coûteux. Contactez-nous pour vous aider à sélectionner les filtres appropriés à votre application.

Comment Edmund Optics compose-t-elle des paires de filtres ?

Edmund Optics propose des dizaines de filtres optiques en stock et prêts à être expédiés qui s'inscrivent dans les régions d'excitation et d'émission de chaque fluorophore spécifié. Nous facilitons la recherche rapide de filtres par fluorophore. Il suffit de parcourir les filtres recommandés qui correspondent à la longueur d'onde d'excitation ou d'émission maximale, avec une transmission maximale à cette longueur d'onde. Pour les applications de microscopie à fluorescence utilisant plusieurs fluorophores, sources laser, filtres dichroïques ou séparateurs de faisceau alternatifs, ou pour les applications plus complexes que les configurations typiques de microscopes à fluorescence, contactez-nous pour discuter de vos spécifications.

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